Ausgangsmaterialien

Die sogenannten Nucleosid-Phosphoramidite.

Zum Synthesestart ist ein mit dem jeweiligen 3’-Nucleosid des zu synthetisierenden Oligos derivatisiertes Trägermaterial notwendig. Üblicherweise ist das Startnucleosid über basenlabile Linker an Controlled Pore Glass (CPG) oder Polystyrol Beads (CPG) gekoppelt:

 

Synthesezyklus

Die chemische Synthese von Oligonucleotiden wird von 3’ in 5’-Richtung durchgeführt. Im entscheidenden Kopplungsschritt reagiert ein 3’-Phosphoramidit mit einer freien 5’-Hydroxygruppe:

 

a)Tritylabspaltung (Deblocking):

Als Abspaltreagenz dient Di- bzw. Trichloressigsäure in Dichlormethan.

 

b) Kopplung (Coupling):

 

c) Blockieren (Capping):

Da der Kopplungsschritt (wie jede chemische Reaktion) nicht zu 100% vollständig verläuft, muß verhindert werden, dass zurückbleibende freie OH-Gruppen (ca. 1%) im folgenden Synthesezyklus mitreagieren können und so zu unspezifischen Sequenzen führen. Im Capping-Schritt werden sämtliche freien reaktiven Gruppen durch Acetylierung blockiert, sie spielen für die weitere Synthese dann keine Rolle mehr.

 

d) Oxidation:

Die im Kopplungsschritt entstandene internucleotidische Phosphitgruppierung wird durch Iodlösung (Schwefel / Thioat Oligos) zum Phosphat oxidiert.

Ein neuer Synthesezyklus wird wieder mit Schritt a) begonnen.

Diese Reaktionen werden wiederholt bis die gewünschte Oligonucleotidsequenz hergestellt ist.

Das verbleibende, noch auf dem CPG gebundenen, Oligonucleotid kann entweder mit freier 5’-OH-Gruppe oder mit geschützter 5-OH-Gruppe (DMT) aus dem Zyklus entlassen werden.



Nach erfolgter Synthese sind folgende weitere Aufarbeitungsschritte notwendig:

Abspaltung des Oligonucleotids vom Trägermaterial und Basenschutzgruppen:

Durch Behandlung des trägergebundenen Oligonucleotids mit konzentrierter Ammoniaklösung wird die Esterbindung zwischen 3’-OH des Oligos und Träger gespalten, das Oligo "schwimmt" in ammoniakalischer Lösung.

Zur Entfernung der Schutzgruppen an den Adenin- Guanin- und Cytidin-Basen und damit zur Freisetzung der exozyklischen Aminofunktionen, wird die ammoniakalische Oligonucleotidlösung bei erhöhter Temperatur erhitzt (üblicherweise zwischen 50°C und 80°C, 1 – 8 Std. je nach Protokoll und verwendeter Schutzgruppen)

Träger- und Schutzgruppenabspaltung können auch in einer „Eintopfreaktion“ durchgeführt werden.

 

Kopplungseffizienz pro Base

Unter einer Kopplungseffizienz versteht man in der DNA-Synthese die Effizienz, mit der ein neues Phosphoramidit an die wachsende Oligonucleotid-Kette gekoppelt wird, also die Ausbeute über die Schritte eines Reaktionszyklus.

Zu Beginn eines jeden Kopplungszyklus wird zur Freisetzung der reaktiven 5’-OH-Gruppe die Dimethoxytritylschutzgruppe mit Säure abgespalten [siehe Synthesezyklus a)]. Hierbei entsteht ein Dimethoxytrityl-Kation, dessen Menge photometrisch bzw. durch Leitfähigkeitsmessung bestimmt werden kann.

Unter Annahme einer vollständigen Abspaltung der DMT-Gruppe von der Oligonucleotid-Kette kann aus der Menge an DMT-Kation auf die Effizienz des vorhergegangenen Kopplungsschritts geschlossen werden. Diese „Tritylwerte“ und damit die Kopplungseffizienz sind ein Maß für die Güte des Syntheseverlaufs.

Die durchschnittliche Kopplungseffizienz während einer Oligonucleotidsynthese hat einen dramatischen Einfluß auf die theoretisch erhaltbare prozentuale Menge an Zielsequenz:

% Zielsequenz = (durchschnittl. schrittweise Kopplungsausbeute)Anzahl Basen

Die vorstehende Graphik zeigt, dass z. B ein 80mer Rohprodukt bei einer sehr guten durchschnittlichen Kopplungsausbeute von 99 % rein rechnerisch deutlich unter 50% Zielsequenz enthalten muss; der Rest besteht aus kürzeren n-x Produkten. Je nach Experiment muss daher gut abgewogen werden, mit welchem Verfahren das Roholigonucleotid weiter aufgereinigt werden soll.