Stoffmenge in nmol

Anhand des Lambert-Beer’schen Gesetzes (E = Epsilon * C * d) kann aus der Extinktion E (OD-Wert) auf die Konzentration C und damit die Stoffmenge umgerechnet werden. Strenggenommen ist der Extinktionskoeffizient Epsilon für jede Oligonucleotidsequenz anders und müsste jeweils empirisch bestimmt werden. Durch das Nearest-Neighbor-Verfahren kann er auch relativ genau berechnet werden. In guter Näherung entspricht er der Summe der Extinktionskoeffizienten der in der Sequenz vorhandenen einzelnen Nucleotide. Mit den Sequenzdaten und des OD-Wertes lässt sich die Stoffmenge folgendermaßen berechnen:

n [OD]: OD Angabe \ n [nmol]: Menge in nmol \ A,G,C,T: Anzahl der enthaltenen Basen im Oligonucleotid

In Abhängigkeit der Oligolänge ergeben sich bei gemischten Sequenzen folgende Werte für die Stoffmenge (nmol):

OD Oligolänge (Anz. Nucleotide)
  10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
1 9,4 4,7 3,1 2,3 1,9 1,6 1,3 1,2 1,0 0,9
3 28 14 9 7 5,6 4,7 4,0 3,5 3,1 2,8
10 94 47 31 23 19 16 13 12 10 9
25 234 117 78 59 47 39 3A«3 29 26 23
100 937 468 312 234 187 156 134 117 104 94

 

 

Schmelztemperatur Tm

Die Schmelztemperatur Tm eines DNA-Doppelstrangs ist als die Temperatur definiert, bei der 50 % des Doppelstrangs in einsträngiger Form vorliegt. Wichtigen Einfluß auf den Tm-Wert haben Länge ,Zusammensetzung und Konzentration eines Oligonucleotids, sowie die Salzkonzentration der Lösung. Es existieren unterschiedliche, mehr oder weniger genaue Verfahren zur Vorhersage von Schmelztemperaturwerten:

 

a) Wallace-Regel (2 + 4 Regel)

Diese für sehr kurze Oligonucleotide gültige Regel (bis ca. 15 Basen) geht von einem Beitrag von 2 Grad für jedes AT-Paar und von 4 Grad für jedes GC-Paar zur Schmelztemperatur eines DNA-Doppelstranges aus:

Tm = 2°C*(A+T)+4°C*(G+C)

Diese Regel wurde für Hybridisierungen an membrangebundene Oligonucleotide erstellt und legt eine Salzkonzentration von 1 M zu Grunde. Für Lösungsexperimente sollten zu der errechneten Temperatur 8 Grad hinzuaddiert werden.

 

b) Berechnung anhand des GC-Gehalts

Die folgende auf Howly et al. [2][3] zurückgehende Formel berücksichtig im wesentlichen den GC-Gehalt und ist für lange Oligonucleotide gültig:

Tm = 81,5 + 0,41 (%GC) + 16,6 log c(M+) – 500/n –0,61 (%F) –1,2 D

%GC = Prozentualer Anteil an G/C-Paaren \ c(M+) = Konzentration an monovalenten Kationen

n = Anzahl der Nucleotide \ %F = Prozentualer Anteil von Formamid im Puffer \ D = Prozentualer Mismatch-Anteil

 

c) Nearest-Neighbor-Verfahren

Das sogenannte Nearest-Neighbor-Verfahren berücksichtigt bei der Berechnung der Tm-Werte auch die sequenzabhängigen Stackingeffekte und basiert auf den thermodynamischen Daten benachbarter Nucleotidpaare. Dieses Verfahren liefert für Oligonucleotide mittlerer Länge (20 – 60 Basen) verlässliche Werte.

Tm = [(1000 x dH) /(A + dS + R x ln (C/4))] – 273.15 + 16,6 x log c(K+)

dH = Summe der Enthalpien der Paare \ dS = Summe der Entropien der Paare

A = -10.8 cal, Entropie der Helixbildung \ R = 1.984 cal/grad x mol, Gaskonstante

C = Oligonucleotidkonzentration (250 pmol/l) \ c(K+) = Konzentration der Kaliumionen in der Oligolösung (50 mmol/l)

 

Berechnung des Molekulargewichts

Das Molekulargewicht eines Oligonucleotids wird aus der Anzahl der einzelnen Nucleotide und evtl. vorhandener Modifikationen berechnet:

MWoligo = (313.2*A+329.2*G+289.2*C+304.2*T+Mwmod.-62)*(g/mol)

A,G,C,T: Anzahl der vorhandenen Basen im Oligo

MWmod: Molekulargewicht einer Modifikation, wenn vorhanden

Beispiel:

5’- CCA GGC AGT CTT ATT TTG ACT-3’

MW = 313,2 * 4 + 329,2 * 4 + 289,2 * 5 + 304,2 * 8 –62 = 6387,2 g/mol