Die klassischen Methoden für die Peptidsynthese in Lösung sind durch zahlreiche Publikationen 6)-9) zusammengefasst worden. Der Nachteil von diesen Methoden zur Herstellung von Peptiden und Proteinen besteht darin, dass sie sehr zeitraubend sind und zum Teil unvorhersehbare Löslichkeitscharakteristiken von Zwischenprodukten aufweisen. Die solid-phase peptide synthesis (SPPS), welche von R.B. Merrifield entwickelt wurde, zeigt sich als die Methode der Wahl zur Synthese von Peptiden und kleineren Proteinen mit spezifischer Sequenz (Schema 1).

Das Konzept der solid-phase peptide synthesis (SPPS) (Schema 2) beinhaltet die kovalente Bindung der wachsenden Aminosäurekette an ein Harz (Resin), so dass unreagierte lösliche Reagenzien durch Waschen des Harzes und Filtration einfach entfernt werden können. Das an das Harz kovalent gebundene und somit unlösliche Peptid wird durch sich wiederholende Serien von Aminosäurekupplungen verlängert. Diese Kupplungen zeichnen sich durch ihre hohen Ausbeuten und Reproduzierbarkeiten aus. Häufig wird ein Überschuss an löslichen Reagenzien verwendet, um eine vollständige Reaktion zu erzielen. Die Einfachheit des sich wiederholenden Ablaufs zur Kupplung einer neuen Aminosäure an das vorhandene Peptid erlaubt die Automatisierung des gesamten Prozesses. So bald die gewünschte Peptidsequenz mittels SPPS synthetisiert wurde, wird das Roh-Peptid vom Harz getrennt. Dies geschieht unter geeigneten Bedingungen, welche sensitive Seitenketten im Peptide nicht beeinflussen. Zu guter Letzt wird das Roh-Peptid aufgereinigt und analysiert.

Schema 1 Vereinfachte Darstellung des Ablaufes einer SPPS.

Schema 2 Konzept der SPPS.



Schutzgruppen

Ein wichtiger Teil in der Peptid-Synthese ist das Schützen von funktionellen Gruppen, welche bei den Reaktionen zur Bildung der Peptidbindung (Kupplung von Aminosäuren) nicht reagieren sollen. Schutzgruppen werden für die Aminogruppe der Aminosäuren benötigt, welche ihre aktivierte Carboxylgruppe zur Aminosäurekupplung beitragen (Carboxyl-Komponente). Ebenfalls soll die Carboxylgruppe der Aminosäure geschützt werden, welche an ihrer Aminogruppe acyliert wird (Amino-Komponente). Wenn nun das resultierende Dipeptid um weitere Aminosäuren verlängert werden soll, muss eine der Schutzgruppen wieder entfernt werden. Dies sollte unter Bedingungen möglich sein, welche die gebildete Peptidbindung oder die jeweilige noch vorhandene Schutzgruppe, man spricht von "semi-permanenten Schutzgruppen", nicht beeinflussen. Für die SPPS werden verschiedene Arten des Schützens benötigt. Funktionelle Gruppen von Aminosäurenseitenketten müssen mit Schutzgruppen geschützt werden, die gegenüber den Bedingungen, welche bei den sich wiederholenden Kupplungsreaktionen auftreten (Entfernung der Nα-Terminalen Schutzgruppe und die Aminosäurekupplungen), stabil sind. Solche Seitenkettenschutzgruppen werden üblicherweise als "permanente Schutzgruppen" bezeichnet. Die kovalente Peptid-Resin-Bindung wird als Schützen des C-Terminals verstanden und verhindert so deren Reaktion bei der Bildung der Aminosäuresequenz.

Die Spaltung von 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) geschieht unter milden basischen, nicht hydrolytischen Bedingungen. Unter diesen Bedingungen werden die Peptidbindungen und Boc-geschützten Seitenketten der Aminosäuren nicht beinflusst. Die Fmoc-Schutzgruppe ist mit primären oder sekundären Aminen spaltbar, gegenüber tertiären Aminen ist sie jedoch weitgehend stabil. 20% Piperidin in DMF ist das Reagenz der Wahl und spaltet die Fmoc-Schutzgruppe komplett in ungefähr 2 min.

Kupplungsmethoden bei der Fmoc/tBu-Strategie:

Die am meisten verwendete Kupplungsmethode in der Fmoc-SPPS ist die Aktivester-Methode, welche entweder über eine Voraktivierung der Carbonsäuregruppe der zu kuppelnden Aminosäure verläuft, oder direkt in-situ (ohne Voraktivierung) durchgeführt wird. Aktivester, welche aus p-Nitrophenyl oder N-Hydroxysuccinimid hergestellt werden, wurden sehr häufig verwendet. Heute werden hauptsächlich der Pentafluorophenyl (OPfp)-Ester oder der 3-Hydroxy-2,3-dihydro-4-oxo-benzotriazon (ODhbt)-Ester synthetisiert. Reaktionen mit HOBt sind eher langsam. HOBt wird eher als sekundär Aktivierungsreagenz eingesetzt. Viele Reaktionen werden jedoch direkt in-situ durchgeführt. Für diesen Zweck eignen sich Aktivierungsreagenzien wie DCC, HBTU, BOP, BOP-Cl oder TBTU. Die Verwendung eines geeigneten Carbodiimids ist nach wie vor sehr beliebt, obwohl ungewollte Nebenreaktionen auftreten können. TBTU und HBTU als Aktivierungsreagenzien sowie auch BOP und BOP-Cl können hier Abhilfe schaffen. Kupplungsmethoden über sekundäre Aktivierungsreagenzien werden, nach Popularität geordnet, in dieser Reihenfolge verwendet: BOP/HOBt > Carbodiimid/HOBt ~ Carbodiimid/ODhbt > Carbodiimid/OPfp.

Solid-Phase Peptide Synthesis (SPPS)

Die Solid-Phase Peptide Synthesis (SPPS) besteht aus drei wesentlichen Schritten. 1) Aufbau der Aminosäurekette zum Peptid, 2) Spaltung des synthetisierten Peptids vom Harz und 3) Reinigung und Charakterisierung. Für die Synthese der Aminosäurekette sind unterschiedliche Strategien bekannt, wie Sie im Kapitel Kupplungsmethoden beschrieben wurden. Auch für die Spaltung des Peptids vom Harz und das Entschützen gibt es verschiedene Methoden, wie wir dann im Kapitel Entschützen sehen werden. Für die Aufreinigung und die Charakterisierung sind die Methoden jedoch eher beschränkt.

Bei den heutzutage gebräuchlichsten SPPS-Strategien wird entweder eine Säure-labile α-Amino-Schutzgruppe (Boc) oder eine Basen-labile α-Amino-Schutzgruppe (Fmoc) verwendet. Beide Strategien benötigen unterschiedliche Aminosäure-Seitenketten-Schutzgruppen. Auch die Spaltung des synthetisierten Peptids vom Harz und die Aufreinigung sind unterschiedlich. Die Boc/Bzl-Strategie wurde in den letzten 25 Jahren intensiv verbessert und ermöglichte so die Synthese von unzähligen komplexen und langen Peptiden wie zum Beispiel IGF-I und IGF-II. Auch die Fmoc/tBu-Strategie wurde weiter entwickelt und kommt vor allem bei der Synthese von kürzeren Peptiden zum Einsatz.

Das Prinzip der stuffenweisen Solid-Phase Peptid Synthesis wurde erstmals von Merrifield angewandt: Eine Nα-Boc gschützte Aminosäure ist kovalent an ein unlösliches Trägermaterial (Harz oder Resin) gebunden. Die Boc-Schutzgruppe wird mittels TFA entfernt und die freie Nα-Aminosäure wird mit NEt3 neutralisiert. Eine weitere Nα-Boc gschützte Aminosäure wird voraktiviert und mit der bereits an das Harz gebundenen Aminosäure zur Kupplung gebracht. Es resultiert ein Dipeptid. Dichlormethan (DCM) oder Dimethylformamid (DMF) wird vorwiegend als Lösungsmittel für die Entschützung und das Kupplungsprozedere verwendet. Überschüssige Reagenzien und Nebenprodukte werden durch einfaches Waschen und Filtrieren entfernt. Die Nα-Schutzgruppe wird gespalten und der Aufbau der Aminosäurekette wird fortgesetzt. Nachdem das gewünschte Peptide durch diesen stuffenweisen Aufbau synthetisiert wurde, werden die Seitenketten-Schutzgruppen der Aminosäuren entfernt und das nun freie Peptid vom Harz gespalten. Das synthetisierte Peptid ist nun in Lösung und wird gereinigt und charakterisiert.

Entschützen

Die chemische Synthese von Peptiden in Lösung oder an der festen Phase, benötigt einen Weg, um das gewünschte Peptid von seinen Schutzgruppen zu befreien, welche das Peptid während der Synthese vor Nebenreaktionen "beschützt". Das Entschützen in saurem Milieu hat sich in vielen Kupplungsstrategien als bester Weg herausgestellt: in der SPPS vor allem bei der Boc/Bzl- und Fmoc/tBu-Strategie.




Starke Säuren sind in diesen Strategien für die Peptidsynthese nicht geeignet, da sie als Entschützungsreagenz wirken.

Während dem Entschützen entstehende Carbokationen (z.B. aus der tBu-Gruppe) führen in Nebenreaktionen zu Alkylierungen. Aufwändige Forschung wurde betrieben, um ihre Bildung zu verringern und den fundamentalen Mechanismus von nicht-wässerigen, sauren Spaltungsreaktionen zu verstehen.

[1] E. Fischer, Chem Ber, 1906, 39, 530-537.
[2] M. Bergmann, L. Zervas, Science, 1935, 81, 180-181.
[3] V. du Vigneaud, C. Ressler, J. Sivan, C.W Roberts, P.G. Katsoyannis, S. Gordon, J. Am. Chem. Soc., 1953, 75, 4879-4880.
[4] J.C. Sheehan, G.P. Hess, J. Am. Chem. Soc., 1955, 77, 1067-1068.
[5] R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 1963, 85, 2149-2154.
[6] E. Wünsch, "Synthese von Peptiden" in "Methoden der organischen Chemie" (Houben-Weyl), 15 Ausg. 4, Teil 1 und 2 Thieme, Stuttgart, 1974.
[7] M. Bodanszky, "Principles of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, Heidelberg, 1984.
[8] M. Bodanszky & A. Bodanszky, "The Practice of Peptide Synthesis", 2. Auflage, Springer-Verlag, Heidelberg, 1994.
[9] M. Bodanszky, Int. J. Peptide Protein Res., 1985, 25, 449-474.